Détermination de la protéine ELISA dans le sérum

CONTEXTE

Le SRAS-CoV-2 est un virus enveloppé avec un génome ARN de sens positif et une nucléocapside à symétrie hélicoïdale. L’entrée du SRAS-CoV-2 dans les cellules hôtes est médiée par la glycoprotéine de pointe transmembranaire (S), qui est la cible principale des anticorps neutralisants lors de l’infection et au centre de la conception thérapeutique et du vaccin.

 

S comprend deux sous-unités fonctionnelles responsables de la liaison au récepteur de la cellule hôte (sous-unité S1) et de la fusion des membranes virale et cellulaire (sous-unité S2). L’immunoglobuline A (IgA) joue un rôle crucial dans la fonction immunitaire des muqueuses. Dans le sang, l’IgA interagit avec le récepteur Fc pour déclencher des réponses inflammatoires.

 

UTILISATION PRÉVUE

 

Le kit SARS-CoV-2 S1 IgA ELISA est un test immunologique hautement sensible et spécifique développé par ImmunoDiagnostics pour la détection qualitative des anticorps de classe IgA contre le S1 du SRAS-CoV-2 dans le sang humain. Ce produit est destiné à un usage de recherche uniquement.

PRINCIPE DU TEST

Les plaques à 96 puits sont recouvertes de protéine SARS-CoV-2 S1 qui capture les anticorps contre la protéine SARS-CoV-2 S1 dans l’échantillon. Après avoir éliminé les matériaux non liés, les IgA capturées contre la protéine SARS-CoV-2 S1 sont détectées par des anticorps monoclonaux anti-IgA humains conjugués à de la peroxydase de raifort (HRP), qui est spécifique de l’IgA humaine, sans réaction croisée avec les IgG humaines ou IgM.

Après l’étape de lavage, le substrat chromogène 3,3 ‘, 5,5’-tétraméthylbenzidine (TMB) est ajouté. La réaction colorée est arrêtée par 2M H 2 ALORS 4. La quantité d’anticorps de classe IgA contre le SARS-CoV-2 S1 capturés à l’intérieur des puits est proportionnelle à la densité de couleur générée dans la réaction d’oxydoréduction couplée.

 

RÉACTIFS FOURNIS

Chaque kit est suffisant pour 96 tests et contient les composants suivants:

 

  1. Un sachet en aluminium avec une plaque de micropuits (12 bandes de 8 puits chacune) enduit de protéine SARS-CoV-2 S1, scellée. Les bandes de micropuits peuvent être utilisées séparément.

 

  1. Tampon de lavage 10 × 40 ml.

 

  1. 5 x tampon de dosage – 20 ml.

 

  1. 100 × solution d’anticorps de détection: anticorps monoclonal anti-IgA humain conjugué à la HRP, 0,12 ml.

 

  1. 10 × anticorps humain anti-S1 (contrôle positif), 22 ul

 

  1. Solution de substrat, 12 ml, prête à l’emploi.

 

  1. Solution d’arrêt, 12 ml, prête à l’emploi.

 

  1. Contrôle à blanc, 0,5 ml, prêt à l’emploi
gentaur
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AUTRES MATÉRIAUX REQUIS, MAIS NON FOURNIS

  1. Pipettes et pointes de pipette.

 

  1. Béchers, flacons, cylindres nécessaires à la préparation des réactifs.

 

  1. Réservoirs de tampon et de réactif.

 

  1. Serviettes en papier ou papier absorbant.
  2. . Lecteur de plaque capable de lire l’absorbance à 450 nm.

 

  1. Eau distillée ou eau désionisée.

 

  1. Calculatrice statistique avec programme pour effectuer une analyse de régression.

ESPACE DE RANGEMENT

l Le kit doit être conservé entre 2 et 8 ° C et tous les réactifs doivent être équilibrés à température ambiante

 

Avant utilisation. Immédiatement après l’utilisation, les réactifs restants doivent être remis dans une chambre froide (2-8 ° C).

 

l La date d’expiration du kit et des réactifs est indiquée sur les étiquettes.

 

l Une fois ouvertes, les bandelettes peuvent être conservées entre 2 et 8 ° C pendant un mois maximum.

 

INSTRUCTIONS DE COLLECTE ET DE STOCKAGE DES ÉCHANTILLONS

Manipulez l’échantillon de sérum ou de plasma conformément aux directives du Comité national des normes de laboratoire clinique pour prévenir la transmission de l’infection par le sang.

 

l N’utilisez pas d’échantillons fortement hémolysés ou lipémiques.

 

l Sérum humain: utilisez un tube séparateur de sang et laissez l’échantillon coaguler pendant 30 minutes, puis

 

centrifuger pendant 10 minutes à 1000g. Lorsque le sérum humain est testé, il doit être dilué au moins 100 fois.

 

l Plasma humain: traiter le sang avec un anticoagulant tel que le citrate, l’EDTA ou l’héparine. Centrifuger

 

pendant 10 minutes à 1000 g dans les 30 minutes pour la collecte de plasma. Lorsque le plasma humain est testé, il doit être dilué au moins 100 fois.

 

l Les échantillons ne peuvent pas être testés immédiatement doivent être aliquotés et doivent être conservés congelés ci-dessous – 20 ° C. Évitez les cycles de congélation-décongélation répétés.

 

l Effectuer une expérience préliminaire pour déterminer la dilution optimale de l’échantillon de détection.

 

PRÉCAUTIONS D’EMPLOI

l Tous les produits chimiques doivent être considérés comme potentiellement dangereux. Eviter le contact avec la peau et les yeux. En cas de contact avec la peau ou les yeux, laver à l’eau. l N’utilisez pas les réactifs du kit au-delà de la date de péremption. l N’exposez pas les réactifs du kit à une forte lumière. l Ne pas pipeter à la bouche.

 

l Ne pas manger ni fumer dans la zone où les réactifs ou les échantillons du kit sont manipulés. l Utilisez uniquement un volume d’échantillon suffisant comme indiqué dans les étapes de la procédure. Ne pas le faire, peut entraîner une faible sensibilité du test.

 

l Évitez le contact de la solution de substrat avec des agents oxydants et du métal. l Utilisez des pointes et / ou des pipettes jetables. l Utilisez des plateaux de réactifs propres et dédiés pour distribuer le conjugué et le réactif de substrat.

l Ne touchez pas le fond extérieur des puits; les empreintes digitales ou les rayures peuvent interférer avec en train de lire. Lors de la lecture des résultats, assurez-vous que le fond de la plaque est sec et qu’il n’y a pas de bulles d’air à l’intérieur des puits.

 

l L’activité enzymatique du conjugué HRP peut être affectée par la poussière et les réactifs des produits chimiques et des substances comme l’hypochlorite de sodium, des acides, des alcalis, etc. N’effectuez pas le test en présence de ces substances.

 

l La solution de substrat doit être à température ambiante avant utilisation.

 

PRÉPARATION DES RÉACTIFS

gentaur
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Amenez tous les réactifs et matériaux à température ambiante avant utilisation

 

  1. 1 × tampon de lavage.

Préparer 1 × tampon de lavage en mélangeant le tampon de lavage 10 × (40 ml) avec 360 ml d’eau distillée ou d’eau désionisée. Si des précipités sont observés dans le flacon de tampon de lavage 10 ×, réchauffez le biberon dans un bain-marie à 37 ° C jusqu’à ce que les précipités disparaissent. Le tampon de lavage 1 × peut être conservé entre 2 et 8 ° C pendant un mois maximum.

 

  1. 1 × tampon de test.

Préparer 1x tampon de test en mélangeant le tampon de test 5x (20 ml) avec 80 ml d’eau distillée ou d’eau désionisée. Si des précipités sont observés dans le flacon de tampon de dosage 5x, réchauffez le flacon dans un bain-marie à 37 ° C jusqu’à ce que les précipités disparaissent. Le tampon de test 1x peut être conservé entre 2 et 8 ° C pendant un mois maximum.

 

  1. 1 × solution d’anticorps de détection.

Faites tourner brièvement la solution d’anticorps de détection 100 × et diluez la quantité souhaitée de l’anticorps 1: 100 avec un tampon de test 1 ×, 100 μL de solution d’anticorps de détection 1 × sont nécessaires par puits. Préparez seulement autant de solution d’anticorps de détection 1 × que nécessaire. Remettre la solution d’anticorps de détection 100 × à 2-8 ° C immédiatement après avoir pipeté le volume nécessaire.

 

PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS ET CONTRÔLE POSITIF

Un échantillon de sérum ou de plasma est généralement requis Dilution 100 fois dans le tampon de test 1X. Une étape de dilution suggérée consiste à ajouter 2 μL d’échantillon à 198 μL de tampon de test 1X. Le facteur de dilution peut être ajusté en fonction du titre des anticorps dans les échantillons.

 

Centrifuger brièvement le tube. Ajouter 200 μL de tampon de test 1X et bien mélanger.

 

PROCÉDURE DE DOSAGE

Il est recommandé que tous les échantillons soient analysés en double.

 

  1. 100 μl de contrôle à blanc et 100 μl de contrôle positif dans leurs puits respectifs, et incuber à température ambiante pendant 1 heure, de préférence sous agitation à 600 tr / min. Un test en double est recommandé.

 

  1. Jeter le contenu et tapoter la plaque sur une serviette en papier propre pour éliminer la solution résiduelle dans chaque puits. Ajouter 300 µl de tampon de lavage 1 × dans chaque puits et incuber pendant 1 minute. Jeter le tampon de lavage 1 × et tapoter la plaque sur une serviette en papier propre pour éliminer le tampon de lavage résiduel. Répétez l’étape de lavage 3 fois au total.

 

  1. Ajouter 100 µl de solution d’anticorps de détection 1 × dans chaque puits, incuber à température ambiante pendant 1 heure.

 

  1. Lavez chaque puits 3 fois comme décrit à l’étape 2.

 

  1. Ajouter 100 µl de solution de substrat dans chaque puits, incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Protéger de la lumière.

 

  1. Ajouter 100 µl de solution d’arrêt à chaque puits, tapoter doucement le cadre de la plaque pendant quelques secondes pour assurer un mélange complet.

 

  1. Déterminez immédiatement la densité optique de chaque puits à 450 nm.
gentaur
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DONNEES TYPIQUES

 

VIDE 0,086 1 0,403
1 0,121 2 0,652
2 0,153 3 1,056
3 0,154 4 0,501
4 0.201 5 2.474
5 0,181 6 0,831
6 0,195 7 0,595
7 0,19 COVID-19 [feminine 8 0,353
Sujets de santé 8 0,2 les patients 9 6,039
9 0,168 dix 0,317
dix 0,192 11 3,769
11 0,141 12 0,408
12 0,113 13 0.807
13 0,162 14 4,272
14 0,099 15 6.243
15 0,145 16 3,146

 

DISPOSITION DES DONNÉES

 

BLK BLK S7 S7 S15 S15 S23 S23 S31 S31 S39 S39
PC PC S8 S8 S16 S16 S24 S24 S32 S32 S40 S40
S1 S1 S9 S9 S17 S17 S25 S25 S33 S33 S41 S41
S2 S2 S10 S10 S18 S18 S26 S26 S34 S34 S42 S42
S3 S3 S11 S11 S19 S19 S27 S27 S35 S35 S43 S43
S4 S4 S12 S12 S20 S20 S28 S28 S36 S36 S44 S44
S5 S5 S13 S13 S21 S21 S29 S29 S37 S37 S45 S45
S6 S6 S14 S14 S22 S22 S30 S30 S38 S38 S46 S46
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PRÉCISION

Intra-essai: Trois niveaux différents connus de contrôle positif ont été ajoutés dans le tampon d’échantillon en tant qu’échantillons de test. Tous les échantillons ont été testés sur la même plaque pour évaluer la précision intra-test du kit. La précision intra-test de ce kit est inférieure à 8%.

 

Inter-analyse : Trois niveaux de contrôle connus différents ont été ajoutés au tampon d’échantillon en tant qu’échantillons de test. Tous les échantillons ont été testés dans 3 dosages séparés pour évaluer la précision intra-dosage du kit. La précision inter-essai de ce kit est inférieure à 10%.

SENSIBILITÉ ET SPÉCIFICITÉ

Nous avons testé ce test dans des échantillons sanguins de 16 patients COVID-19 bien caractérisés, et tous étaient positifs pour les IgA anti-SARS-CoV-2 S1. 20 échantillons de sang d’individus sains ont été testé, et aucun d’entre eux n’était positif.

 

La sensibilité de ce test est ≥ 96%, et la spécificité de ce test est ≥95%.