PRÉPARATION DES RÉACTIFS

 

Amenez tous les réactifs et matériaux à température ambiante avant utilisation

 

1. 1 × tampon de lavage.
   Préparer 1 × tampon de lavage en mélangeant le tampon de lavage 10 × (40 ml) avec 360 ml d’eau distillée ou d’eau désionisée. 【 MISE EN GARDE!!! 】 Siles précipités sont observés dans le flacon de tampon de dosage 5x, chauffer le flacon dans un bain-marie à 37 ° C jusqu’à ce que les précipités disparaissent. Une dissolution incomplète entraînera un bruit de fond élevé. Le 1 × Wash Le tampon peut être conservé entre 2 et 8 ° C pendant un mois maximum.

 

2. 1 × tampon de test.
   Préparer 1x tampon de test en mélangeant le tampon de test 5x (20 ml) avec 80 ml d’eau distillée ou d’eau désionisée. 【 MISE EN GARDE!!! 】 Siles précipités sont observés dans le flacon de tampon 10xWash, réchauffer le flacon dans un lot d’eau à 37 ° C jusqu’à ce que les précipités disparaissent. Une dissolution incomplète entraînera un bruit de fond élevé. Le test 1x Le tampon peut être conservé entre 2 et 8 ° C pendant un mois maximum.

 

3. 1 × solution d’anticorps de détection.
   Faites tourner brièvement la solution d’anticorps de détection 100 × et diluez la quantité souhaitée de l’anticorps 1: 100 avec un tampon de test 1 ×, 100 μL de solution d’anticorps de détection 1 × sont nécessaires par puits. Préparez seulement autant de solution d’anticorps de détection 1 × que nécessaire. Remettre la solution d’anticorps de détection 100 × à 2-8 ° C immédiatement après avoir pipeté le volume nécessaire.

PRÉPARATION DU STANDARD ET DES ÉCHANTILLONS

 

Préparation standard:

 

 

Centrifuger brièvement le tube standard avant d’ouvrir le capuchon. Ajouter 450 μL de tampon de test 1 × dans le standard Anti-S1 mAb 10 × (50 μL) pour générer le premier standard (10 ng / ml). Préparez les standards dilués en série en utilisant 1 × tampon de test comme suit:

			Volume standard	Volume de 1 ×	Concentration
				tampon de test
1			10 ng / ml	–	10 ng / ml
2			250 µL de 10 ng / ml 250 µL	250 µL	5 ng / ml
3			de 5 ng / ml 250 µL de 2,5	250 µL	2,5 ng / ml
4			ng / ml 250 µL de 1,25 ng /	250 µL	1,25 ng / ml
5			ml	250 µL	0,625 ng / ml

 

 

1x tampon de test sert de blanc (0 ng / ml).

 

Remarque: Le stock standard reconstitué doit être aliquoté et conservé entre 2 et 8 ℃ jusqu’à un mois.

 

La préparation des échantillons:

 

Un échantillon de sérum ou de plasma est généralement requis Dilution 100 fois dans le tampon de test 1X. Une étape de dilution suggérée consiste à ajouter 2 μL d’échantillon à 198 μL de tampon de test 1X. Le facteur de dilution peut être ajusté en fonction du titre des anticorps dans les échantillons.

 

PROCÉDURE DE DOSAGE

 

Il est recommandé que tous les standards et échantillons soient analysés en double.

 

1. Ajouter 100 µl d’étalons ou d’échantillons par puits et incuber à température ambiante pendant 1 heure, sous agitation à 600 tr / min. (Remarque: l’incubation sans secousse diminue proportionnellement le signal d’environ 30%. Si aucun agitateur n’est disponible, prolongez le temps d’incubation à 2 heures).

 

2. Jeter le contenu et tapoter la plaque sur une serviette en papier propre pour éliminer la solution résiduelle dans chaque puits. Ajouter 300 µl de tampon de lavage 1 × dans chaque puits et incuber pendant 1 minute. Jeter le tampon de lavage 1 × et tapoter la plaque sur une serviette en papier propre pour éliminer le tampon de lavage résiduel. Répétez l’étape de lavage 4 fois au total.

 

 

3. Ajouter 100 µl de solution d’anticorps de détection 1 × dans chaque puits, incuber à température ambiante pendant 1 heure.

 

4. Lavez chaque puits 4 fois comme décrit à l’étape 2.

 

5. Ajouter 100 µl de solution de substrat dans chaque puits, incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Protéger de la lumière.

 

6. Ajouter 100 µl de solution d’arrêt à chaque puits, tapoter doucement le cadre de la plaque pendant quelques secondes pour assurer un mélange complet.

 

7. Déterminez immédiatement la densité optique de chaque puits à 450 nm.

CACULATION

 

1. Soustrayez l’absorbance du blanc de celle des standards et des échantillons.

 

2. Générez une courbe standard en traçant l’absorbance obtenue (axe y) par rapport au mAb anti-S1 humain (axe x). La meilleure ligne d’ajustement peut être générée avec n’importe quel logiciel d’ajustement de courbe par analyse de régression. Toute courbe d’ajustement de courbe à 4 paramètres ou log-log peut être utilisée pour le calcul.

 

3. Déterminer la concentration d’IgG anti-S1 humaines des échantillons à partir de la courbe standard et multiplier la valeur par le facteur de dilution.

 

PRÉCISION

 

Intra-essai: Trois niveaux différents connus de contrôle positif ont été ajoutés dans le tampon d’échantillon en tant qu’échantillons de test. Tous les échantillons ont été testés sur la même plaque pour évaluer la précision intra-test du kit. La précision intra-test de ce kit est inférieure à 5%.

 

Inter-analyse: Trois niveaux de contrôle connus différents ont été ajoutés au tampon d’échantillon en tant qu’échantillons de test. Tous les échantillons ont été testés dans 3 dosages séparés pour évaluer la précision intra-dosage du kit. La précision inter-analyse de ce kit est inférieure à 7%.

 

DONNÉES REPRÉSENTATIVES DES PATIENTS COVID-19 (n = 20) ET DES INDIVIDUS EN SANTÉ

 

	Patient COVID-19				Des individus en bonne santé
Non	OD450	Non	OD450	Non	OD450	N	OD450
						o
1	0,626	11	0,595	1	0,078	11	0,148
2	0,363	12	2,139	2	0,148	12	0,124
3	0,369	13	1,948	3	0,088	13	0,069
4	3,967	14	2,004	4	0,094	14	0,083
5	2,731	15	0,462	5	0,104	15	0,126
6	1,948	16	0,234	6	0,131	16	0,093
7	0,551	17	1,079	7	0,094	17	0,088
8	1.309	18	3,721	8	0,074	18	0,068
9	0,494	19	0,903	9	0,113	19	0,121
dix	1,776	20	3.130	dix	0,13	20	0,186

 

 

SENSIBILITÉ ET SPÉCIFICITÉ

 

Nous avons testé ce test dans des échantillons sanguins de 60 patients COVID-19 bien caractérisés et 58 patients sur 60 étaient positifs pour les IgG anti-SARS-CoV-2 S1. 20 échantillons de sang d’individus en bonne santé ont été testés, et aucun d’entre eux n’était positif. La sensibilité de ce test est ≥ 96%, et la spécificité de ce test est ≥ 95%.