Problèmes les plus fréquemment rencontrés à partir des tests Western blot.

Contents

Le guide suivant sert de liste de contrôle pour les causes et solutions possibles en ce qui concerne certains des problèmes les plus fréquemment rencontrés à partir des tests Western blot.

  1. Contexte élevé
    S.No.Cause possibleSolution1Concentration d’anticorps trop élevée
    1. Optimiser et diminuer la concentration d’anticorps2Formation d’anticorps secondaires agrégés
    2. Filtrer l’anticorps secondaire à travers un filtre de 0,2 μm
    3. Utilisez un nouvel anticorps secondaire3Température d’incubation des anticorps trop élevée
    4. Incuber l’anticorps à 4 ° C4Liaison d’anticorps secondaire non spécifique ou réactivité croisée avec un agent bloquant
    5. Exécuter un contrôle d’anticorps secondaire (sans le principal)
    6. Diminue la concentration d’anticorps secondaire5Réactivité croisée de l’anticorps primaire ou secondaire avec l’agent bloquant
    7. Ajouter Tween-20 à l’incubation et au tampon de lavage6Agent de blocage incompatible
    8. Comparer différents tampons de blocage7Blocage incomplet
    9. Optimiser le choix du tampon de blocage
    10. Augmente la concentration en protéines dans l’agent bloquant
    11. Optimiser le temps de blocage et / ou la température; Bloquer pendant 2 heures à température normale ou toute la nuit à 4 ° C
    12. Ajouter 0,05% de détergent Tween 20 dans l’agent de blocage
    13. Ajouter 0,05% de détergent Tween 20 dans la solution de diluants d’anticorps8Blocage insuffisant
    14. Prolongez le temps de blocage ou utilisez un agent de blocage compatible (par exemple, lait écrémé, BSA, sérum, etc.)9Réactivité croisée de l’anticorps avec d’autres protéines
    15. Utiliser un agent bloquant différent (ne pas utiliser de lait écrémé avec système de biotine
    16. Réduire la concentration d’anticorps secondaire
    17. Tester la réactivité croisée entre l’anticorps secondaire et la membranedixLavage insuffisant
    18. Augmentez le nombre de lavages et le volume de tampon
    19. Ajouter 0,05% de détergent Tween 20 dans le tampon de lavage11Temps d’exposition trop long
    20. Réduisez le temps d’exposition12Problème de membrane
    21. Utilisez des pincettes propres; Opérer avec des gants
    22. Utilisez de nouvelles membranes
    23. Assurez-vous que le liquide est suffisant pour garder la membrane humide
    24. Utiliser une table de décoloration en incubation
    25. Évitez les membranes qui se chevauchent
    26. Manipulez avec soin et évitez d’endommager la membrane13Lavage de membrane insuffisant
    27. Augmentez le nombre de lavage14Membrane incompatible
    28. Le fond de la membrane de nitrocellulose est inférieur à celui de la membrane PVDF15Membrane sèche
    29. Assurez-vous que la membrane est recouverte d’une quantité suffisante de liquide et empêchez-la de sécher16Tampon contaminé
    30. Utilisez un nouveau tampon ou un tampon de filtre avant utilisation17Équipements contaminés
    31. Assurez-vous que tout l’équipement et les outils sont propres et qu’aucun gel ne reste sur la membrane
  2. Signal faible / faible
    S.No.Cause possibleSolution1Mauvais transfert de protéines vers la membrane
    1. Gel de coloration après le transfert pour déterminer si le transfert est efficace
    2. Utilisez Ponceau S pour colorer la membrane afin de déterminer si le transfert est efficace
    3. Assurer un contact suffisant entre le gel et la membrane pendant le transfert
    4. Assurez-vous que le sandwich de transfert est correctement assemblé
    5. Membrane humide selon les instructions
    6. Évitez la surchauffe pendant l’électro-transfert
    7. Utilisez un contrôle positif ou des marqueurs de poids moléculaire
    8. Optimiser le temps de transfert et le courant
    9. Utilisez le tampon de transfert de membrane de Boster (AR1149)
    10. Évitez de détruire l’échantillon (déterminant antigénique) lors de la manipulation2Liaison insuffisante aux protéines et aux membranes
    11. Ajout de 20% de méthanol dans le tampon de transfert
    12. Utiliser une membrane de petit alésage3Anticorps insuffisant
    13. Augmentez la concentration d’anticorps4Antigène insuffisant
    14. Charger plus de protéines5Masquage d’antigène par tampon de blocage
    15. Comparer différents tampons de blocage
    16. Optimiser la concentration en protéines de l’agent bloquant
    17. Réduisez le temps de blocage6Présence d’azide de sodium dans les tampons
    18. Éliminer l’azide de sodium des tampons7Temps d’exposition trop court
    19. Allonger le temps d’exposition du film8Temps d’incubation du substrat trop court
    20. Allonge le temps d’incubation du substrat à cinq minutes9Digestion des protéines sur membrane
    21. Optimiser la quantité d’agent bloquantdixDégradation des protéines pendant le stockage
    22. Recréer l’échantillon de protéines11Anticorps primaires et secondaires incompatibles
    23. Assurez-vous que l’anticorps primaire, l’anticorps secondaire, le substrat, le système enzymatique et les échantillons sont compatibles
    24. Utilisez le contrôle de chargement pour tester l’efficacité du deuxième système de détection12Faible concentration d’anticorps primaire et / ou d’anticorps secondaire
    25. Augmentez la concentration d’anticorps
    26. Augmentez le temps d’incubation13Réactivité croisée entre l’agent bloquant et les anticorps (primaires ou secondaires)
    27. Utilisez un détergent doux tel que Tween20
    28. Agent de blocage du changement (couramment utilisé: lait, BSA, sérum ou gélatine)14Incapacité de l’anticorps primaire à reconnaître la protéine dans l’échantillon testé
    29. Vérifier l’instruction
    30. Utilisez un contrôle positif15Teneur faible ou nulle en protéine cible (antigène inefficace)
    31. Utilisez un contrôle positif
    32. Augmentez la quantité de charge à 20-30 µg de protéines par puits
    33. Utiliser un inhibiteur de protéase ou une protéine cible d’extrait fractionnaire16Transfert insuffisant et lavage excessif
    34. Vérifiez le transfert avec Ponceau S
    35. Faire tremper la membrane PVDF dans le méthanol
    36. Évitez les lavages excessifs17Sur-blocage
    37. Utilisez du lait écrémé à 0,05% ou pas de tampon de diluant pour le lait
    38. Changer l’agent de blocage
    39. Réduisez le temps de blocage18Perte d’efficacité des anticorps primaires
    40. Préparez des anticorps frais et conservez-les correctement lorsqu’ils ne sont pas utilisés
    41. Évitez le gel et le dégel répétés19Inhibition des anticorps secondaires par l’azide de sodium
    42. Évitez d’utiliser de l’azide de sodium avec des anticorps conjugués à HRP20Perte d’efficacité dans le conjugué enzymatique et le substrat
    43. Mélanger le conjugué enzymatique et le substrat (pas de développement de couleur lorsque l’enzyme est inactive)
    44. Utiliser un conjugué enzymatique activé et un substrat frais21Transfert humide incorrect pour la membrane
    45. Faire tremper la membrane PVDF dans 100% de méthanol22Poids moléculaire insuffisant de la protéine cible (<10 kDa)
    46. Utiliser une membrane de petit alésage
    47. Réduisez le temps de transfert23Égalité ou proximité des valeurs entre le point isoélectrique de la protéine cible et le pH du tampon de transfert
    48. Essayez d’autres tampons tels que le tampon CAPS (pH 10,5)
    49. Essayez des tampons à faible pH tels que le tampon d’acide acétique24Concentration de méthanol trop élevée
    50. Diminuez la concentration de méthanol ou utilisez de l’alcool isopropylique