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- Problèmes les plus fréquemment rencontrés à partir des tests Western blot.
Le guide suivant sert de liste de contrôle pour les causes et solutions possibles en ce qui concerne certains des problèmes les plus fréquemment rencontrés à partir des tests Western blot.
- Contexte élevé
S.No.Cause possibleSolution1Concentration d’anticorps trop élevée- Optimiser et diminuer la concentration d’anticorps2Formation d’anticorps secondaires agrégés
- Filtrer l’anticorps secondaire à travers un filtre de 0,2 μm
- Utilisez un nouvel anticorps secondaire3Température d’incubation des anticorps trop élevée
- Incuber l’anticorps à 4 ° C4Liaison d’anticorps secondaire non spécifique ou réactivité croisée avec un agent bloquant
- Exécuter un contrôle d’anticorps secondaire (sans le principal)
- Diminue la concentration d’anticorps secondaire5Réactivité croisée de l’anticorps primaire ou secondaire avec l’agent bloquant
- Ajouter Tween-20 à l’incubation et au tampon de lavage6Agent de blocage incompatible
- Comparer différents tampons de blocage7Blocage incomplet
- Optimiser le choix du tampon de blocage
- Augmente la concentration en protéines dans l’agent bloquant
- Optimiser le temps de blocage et / ou la température; Bloquer pendant 2 heures à température normale ou toute la nuit à 4 ° C
- Ajouter 0,05% de détergent Tween 20 dans l’agent de blocage
- Ajouter 0,05% de détergent Tween 20 dans la solution de diluants d’anticorps8Blocage insuffisant
- Prolongez le temps de blocage ou utilisez un agent de blocage compatible (par exemple, lait écrémé, BSA, sérum, etc.)9Réactivité croisée de l’anticorps avec d’autres protéines
- Utiliser un agent bloquant différent (ne pas utiliser de lait écrémé avec système de biotine
- Réduire la concentration d’anticorps secondaire
- Tester la réactivité croisée entre l’anticorps secondaire et la membranedixLavage insuffisant
- Augmentez le nombre de lavages et le volume de tampon
- Ajouter 0,05% de détergent Tween 20 dans le tampon de lavage11Temps d’exposition trop long
- Réduisez le temps d’exposition12Problème de membrane
- Utilisez des pincettes propres; Opérer avec des gants
- Utilisez de nouvelles membranes
- Assurez-vous que le liquide est suffisant pour garder la membrane humide
- Utiliser une table de décoloration en incubation
- Évitez les membranes qui se chevauchent
- Manipulez avec soin et évitez d’endommager la membrane13Lavage de membrane insuffisant
- Augmentez le nombre de lavage14Membrane incompatible
- Le fond de la membrane de nitrocellulose est inférieur à celui de la membrane PVDF15Membrane sèche
- Assurez-vous que la membrane est recouverte d’une quantité suffisante de liquide et empêchez-la de sécher16Tampon contaminé
- Utilisez un nouveau tampon ou un tampon de filtre avant utilisation17Équipements contaminés
- Assurez-vous que tout l’équipement et les outils sont propres et qu’aucun gel ne reste sur la membrane
- Signal faible / faible
S.No.Cause possibleSolution1Mauvais transfert de protéines vers la membrane- Gel de coloration après le transfert pour déterminer si le transfert est efficace
- Utilisez Ponceau S pour colorer la membrane afin de déterminer si le transfert est efficace
- Assurer un contact suffisant entre le gel et la membrane pendant le transfert
- Assurez-vous que le sandwich de transfert est correctement assemblé
- Membrane humide selon les instructions
- Évitez la surchauffe pendant l’électro-transfert
- Utilisez un contrôle positif ou des marqueurs de poids moléculaire
- Optimiser le temps de transfert et le courant
- Utilisez le tampon de transfert de membrane de Boster (AR1149)
- Évitez de détruire l’échantillon (déterminant antigénique) lors de la manipulation2Liaison insuffisante aux protéines et aux membranes
- Ajout de 20% de méthanol dans le tampon de transfert
- Utiliser une membrane de petit alésage3Anticorps insuffisant
- Augmentez la concentration d’anticorps4Antigène insuffisant
- Charger plus de protéines5Masquage d’antigène par tampon de blocage
- Comparer différents tampons de blocage
- Optimiser la concentration en protéines de l’agent bloquant
- Réduisez le temps de blocage6Présence d’azide de sodium dans les tampons
- Éliminer l’azide de sodium des tampons7Temps d’exposition trop court
- Allonger le temps d’exposition du film8Temps d’incubation du substrat trop court
- Allonge le temps d’incubation du substrat à cinq minutes9Digestion des protéines sur membrane
- Optimiser la quantité d’agent bloquantdixDégradation des protéines pendant le stockage
- Recréer l’échantillon de protéines11Anticorps primaires et secondaires incompatibles
- Assurez-vous que l’anticorps primaire, l’anticorps secondaire, le substrat, le système enzymatique et les échantillons sont compatibles
- Utilisez le contrôle de chargement pour tester l’efficacité du deuxième système de détection12Faible concentration d’anticorps primaire et / ou d’anticorps secondaire
- Augmentez la concentration d’anticorps
- Augmentez le temps d’incubation13Réactivité croisée entre l’agent bloquant et les anticorps (primaires ou secondaires)
- Utilisez un détergent doux tel que Tween20
- Agent de blocage du changement (couramment utilisé: lait, BSA, sérum ou gélatine)14Incapacité de l’anticorps primaire à reconnaître la protéine dans l’échantillon testé
- Vérifier l’instruction
- Utilisez un contrôle positif15Teneur faible ou nulle en protéine cible (antigène inefficace)
- Utilisez un contrôle positif
- Augmentez la quantité de charge à 20-30 µg de protéines par puits
- Utiliser un inhibiteur de protéase ou une protéine cible d’extrait fractionnaire16Transfert insuffisant et lavage excessif
- Vérifiez le transfert avec Ponceau S
- Faire tremper la membrane PVDF dans le méthanol
- Évitez les lavages excessifs17Sur-blocage
- Utilisez du lait écrémé à 0,05% ou pas de tampon de diluant pour le lait
- Changer l’agent de blocage
- Réduisez le temps de blocage18Perte d’efficacité des anticorps primaires
- Préparez des anticorps frais et conservez-les correctement lorsqu’ils ne sont pas utilisés
- Évitez le gel et le dégel répétés19Inhibition des anticorps secondaires par l’azide de sodium
- Évitez d’utiliser de l’azide de sodium avec des anticorps conjugués à HRP20Perte d’efficacité dans le conjugué enzymatique et le substrat
- Mélanger le conjugué enzymatique et le substrat (pas de développement de couleur lorsque l’enzyme est inactive)
- Utiliser un conjugué enzymatique activé et un substrat frais21Transfert humide incorrect pour la membrane
- Faire tremper la membrane PVDF dans 100% de méthanol22Poids moléculaire insuffisant de la protéine cible (<10 kDa)
- Utiliser une membrane de petit alésage
- Réduisez le temps de transfert23Égalité ou proximité des valeurs entre le point isoélectrique de la protéine cible et le pH du tampon de transfert
- Essayez d’autres tampons tels que le tampon CAPS (pH 10,5)
- Essayez des tampons à faible pH tels que le tampon d’acide acétique24Concentration de méthanol trop élevée
- Diminuez la concentration de méthanol ou utilisez de l’alcool isopropylique