Recombinant hautement purifié Nucléoprotéine SARS-CoV-2 /

PRÉPARATION DES STANDRADS ET DES ÉCHANTILLONS

 

Norme SARS-CoV-2 NP:

Reconstituer le standard lyophilisé avec 1 ml de tampon de dosage 1x pour générer la première solution standard de 2000 pg / ml. Laisser le standard reposer pendant 10 minutes en agitant doucement avant de procéder aux dilutions. Préparez les standards dilués en série en utilisant 1 × tampon de test comme suit:

 

Volume standard Volume de 1 × tampon de Concentration
test
2000 pg / ml 2000 pg / ml
250 µL de 2000 pg / ml 250 250 µL 1 000 pg / ml
µL de 1000 pg / ml 250 µL de 250 µL 500 pg / ml
500 pg / ml 250 µL de 250 pg 250 µL 250 pg / ml
/ ml 250 µL de 125 pg / ml 250 µL 125 pg / ml
250 µL de 62,5 pg / ml 250 µL 62,5pg / ml
250 µL 31,25 pg / ml

 

1x tampon de test sert de standard zéro (0 ng / ml).

 

Remarque: Le stock standard reconstitué doit être aliquoté et conservé au

 

  • 20 ℃ jusqu’à un mois. Évitez de répéter les cycles de congélation / décongélation. Veuillez ne pas stocker les solutions étalons diluées.La préparation des échantillons:

Le sérum, le plasma ou l’autre échantillon peuvent être mesurés. Une dilution de 2 à 100 fois dans un tampon de test 1 × est recommandée, en fonction des concentrations de NP dans les échantillons.

PROCÉDURE DE DOSAGE

Il est recommandé que tous les standards et échantillons soient analysés dupliquer.

 

  1. Ajouter 100 µl d’étalon ou d’échantillon par puits, sceller la plaque avec un couvercle de plaque. Incuber à température ambiante pendant 1 heure en agitant à 600 tr / min sur un agitateur à micro-plaque horizontale. (De préférence secouer à l’étape d’incubation qui peut améliorer le signal)

 

  1. Jeter le contenu et tapoter la plaque sur une serviette en papier propre pour éliminer la solution résiduelle dans chaque puits. Ajouter 300 µl de tampon de lavage 1 × dans chaque puits et incuber pendant 1 minute.Jeter le tampon de lavage 1 × et tapoter la plaque sur une serviette en papier propre pour éliminer le tampon de lavage résiduel. Répétez l’étape de lavage 4 fois au total.

 

  1. Ajouter 100 µl de solution d’anticorps de détection 1 × dans chaque puits, incuber à température ambiante pendant 1 heure.

 

  1. Lavez chaque puits 4 fois comme décrit à l’étape 2.

 

  1. Ajouter 100 µl de solution de substrat dans chaque puits, incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Protéger de la lumière.

 

  1. Ajouter 100 µl de solution d’arrêt à chaque puits, tapoter doucement le cadre de la plaque pendant quelques secondes pour assurer un mélange complet.

 

  1. Déterminez immédiatement la densité optique de chaque puits à 450 nm.
gentaur
gentaur

 

CALCUL DES RÉSULTATS

Si un échantillon a un niveau de NP supérieur à la norme la plus élevée, le l’échantillon doit être dilué davantage et le test doit être répété.

 

  • Calculer l’absorbance moyenne pour chaque étalon, contrôle et échantillon et soustraire la densité optique standard (DO) moyenne zéro.

 

  • Construire une courbe standard en traçant l’absorbance moyenne pour chaque standard sur l’axe y par rapport à la concentration sur l’axe x et dessiner une courbe de meilleur ajustement à travers les points sur le graphique.
  • La plupart des logiciels graphiques peuvent aider à rendre la courbe et une logistique à quatre paramètres (4PL) fournissent généralement le meilleur ajustement, bien que d’autres équations (par exemple linéaire, log / log) puissent également être essayées pour voir laquelle fournit la plus précise.
    Concentration Calculer NP
    Échantillon Absorbance concentration
    (pg / ml)
    (pg / ml)
    Sérum non dilué de 0,112 – – – –
    contrôle sain
    Dilution 1:10 du sérum d’un 0,126 – – – –
    contrôle sain
    1:10 sérum dilué 2,974 1831 1831
    avec 2000 pg / ml NP
    Dilution 1: 4 du sérum de
    COVID sévère 0,732 418,267 1673,067
    19 patient A
    Dilution 1: 4 du sérum de
    COVID sévère 0,478 248,933 995,733
    19 patient B
    Dilution 1: 4 du sérum de
    COVID sévère 0,432 218,267 873,067
    19 patient C
    Dilution 1: 4 de sérum de
    COVID-19 doux 0,694 392,933 1571,733
    patient D
    Dilution 1: 4 de sérum de
    COVID-19 doux 0,513 272,267 1089,067
    patient E

 

SPIKING ET RÉCUPÉRATION

La récupération a été déterminée en ajoutant différentes concentrations de SARSCoV-2 NP dans les échantillons énumérés ci-dessous. Les récupérations moyennes sont les suivantes:

gentaur
gentaur
Échantillon type Moyenne de récupération (%) Gamme (%)
Sérum 91,5 80-103
Plasma 92 83-106
Milieu de culture cellulaire 85,4 80-90,8

 

REPRODUCTIBILITÉ

 

CV intra-essai%: <5%;

CV inter-essai%: <6%.

 

 

SENSIBILITÉ

La dose minimale détectable (MDD) de SARS-CoV-2 Nucléoprotéine / NP est généralement inférieure à 5 pg / mL. La MDD a été déterminée en ajoutant trois écarts-types à la valeur de densité optique moyenne de vingt réplicats standard zéro et en calculant la concentration correspondante.

 

ÉTALONNAGE

Cet immunoessai est calibré contre une nucléoprotéine / NP SARS-CoV-2 recombinante hautement purifiée produite par ImmunoDiagnostics Inc. (Cat # 41A220).

gentaur
gentaur

RÉSUMÉ DE LA PROCÉDURE DE DOSAGE

Ajouter 100 μl d’étalon ou d’échantillon dans chaque puits.

Incuber à température ambiante pendant 1 heure en agitant à 600 tr / min).

 

Aspirez et lavez chaque bien quatre fois.

Ajouter 100 μl de 1 × solution d’anticorps de détection dans chaque puits.

Incuber à température ambiante pendant 1 heure.

Aspirez et lavez chaque bien quatre fois.

 

Ajouter 100 μl de solution de substrat dans chaque puits.

 

Incuber à température ambiante pendant 15 minutes

Ajouter 100 μl de solution d’arrêt dans chaque puits.

 

Mesurer l’absorbance de chaque puits à 450 nm.