Western Blot

Le guide suivant sert de liste de contrôle pour les causes et solutions possibles en ce qui concerne certains des problèmes les plus fréquemment rencontrés à partir des tests Western blot.

  1. Contexte élevé
    S.No.Cause possibleSolution1Concentration d’anticorps trop élevée
    • Optimiser et diminuer la concentration d’anticorps
    2Formation d’anticorps secondaires agrégés
    • Filtrer l’anticorps secondaire à travers un filtre de 0,2 μm
    • Utilisez un nouvel anticorps secondaire
    3Température d’incubation des anticorps trop élevée
    • Incuber l’anticorps à 4 ° C
    4Liaison d’anticorps secondaire non spécifique ou réactivité croisée avec un agent bloquant
    • Exécuter un contrôle d’anticorps secondaire (sans le principal)
    • Diminue la concentration d’anticorps secondaire
    5Réactivité croisée de l’anticorps primaire ou secondaire avec l’agent bloquant
    • Ajouter Tween-20 à l’incubation et au tampon de lavage
    6Agent de blocage incompatible
    • Comparer différents tampons de blocage
    7Blocage incomplet
    • Optimiser le choix du tampon de blocage
    • Augmente la concentration en protéines dans l’agent bloquant
    • Optimiser le temps de blocage et / ou la température; Bloquer pendant 2 heures à température normale ou toute la nuit à 4 ° C
    • Ajouter 0,05% de détergent Tween 20 dans l’agent de blocage
    • Ajouter 0,05% de détergent Tween 20 dans la solution de diluants d’anticorps
    8Blocage insuffisant
    • Prolongez le temps de blocage ou utilisez un agent de blocage compatible (par exemple, lait écrémé, BSA, sérum, etc.)
    9Réactivité croisée de l’anticorps avec d’autres protéines
    • Utiliser un agent bloquant différent (ne pas utiliser de lait écrémé avec système de biotine
    • Réduire la concentration d’anticorps secondaire
    • Tester la réactivité croisée entre l’anticorps secondaire et la membrane
    dixLavage insuffisant
    • Augmentez le nombre de lavages et le volume de tampon
    • Ajouter 0,05% de détergent Tween 20 dans le tampon de lavage
    11Temps d’exposition trop long
    • Réduisez le temps d’exposition
    12Problème de membrane
    • Utilisez des pincettes propres; Opérer avec des gants
    • Utilisez de nouvelles membranes
    • Assurez-vous que le liquide est suffisant pour garder la membrane humide
    • Utiliser une table de décoloration en incubation
    • Évitez les membranes qui se chevauchent
    • Manipulez avec soin et évitez d’endommager la membrane
    13Lavage de membrane insuffisant
    • Augmentez le nombre de lavage
    14Membrane incompatible
    • Le fond de la membrane de nitrocellulose est inférieur à celui de la membrane PVDF
    15Membrane sèche
    • Assurez-vous que la membrane est recouverte d’une quantité suffisante de liquide et empêchez-la de sécher
    16Tampon contaminé
    • Utilisez un nouveau tampon ou un tampon de filtre avant utilisation
    17Équipements contaminés
    • Assurez-vous que tout l’équipement et les outils sont propres et qu’aucun gel ne reste sur la membrane
  2. Signal faible / faible
    S.No.Cause possibleSolution1Mauvais transfert de protéines vers la membrane
    • Gel de coloration après le transfert pour déterminer si le transfert est efficace
    • Utilisez Ponceau S pour colorer la membrane afin de déterminer si le transfert est efficace
    • Assurer un contact suffisant entre le gel et la membrane pendant le transfert
    • Assurez-vous que le sandwich de transfert est correctement assemblé
    • Membrane humide selon les instructions
    • Évitez la surchauffe pendant l’électro-transfert
    • Utilisez un contrôle positif ou des marqueurs de poids moléculaire
    • Optimiser le temps de transfert et le courant
    • Utilisez le tampon de transfert de membrane de Boster (AR1149)
    • Évitez de détruire l’échantillon (déterminant antigénique) lors de la manipulation
    2Liaison insuffisante aux protéines et aux membranes
    • Ajout de 20% de méthanol dans le tampon de transfert
    • Utiliser une membrane de petit alésage
    3Anticorps insuffisant
    • Augmentez la concentration d’anticorps
    4Antigène insuffisant
    • Charger plus de protéines
    5Masquage d’antigène par tampon de blocage
    • Comparer différents tampons de blocage
    • Optimiser la concentration en protéines de l’agent bloquant
    • Réduisez le temps de blocage
    6Présence d’azide de sodium dans les tampons
    • Éliminer l’azide de sodium des tampons
    7Temps d’exposition trop court
    • Allonger le temps d’exposition du film
    8Temps d’incubation du substrat trop court
    • Allonge le temps d’incubation du substrat à cinq minutes
    9Digestion des protéines sur membrane
    • Optimiser la quantité d’agent bloquant
    dixDégradation des protéines pendant le stockage
    • Recréer l’échantillon de protéines
    11Anticorps primaires et secondaires incompatibles
    • Assurez-vous que l’anticorps primaire, l’anticorps secondaire, le substrat, le système enzymatique et les échantillons sont compatibles
    • Utilisez le contrôle de chargement pour tester l’efficacité du deuxième système de détection
    12Faible concentration d’anticorps primaire et / ou d’anticorps secondaire
    • Augmentez la concentration d’anticorps
    • Augmentez le temps d’incubation
    13Réactivité croisée entre l’agent bloquant et les anticorps (primaires ou secondaires)
    • Utilisez un détergent doux tel que Tween20
    • Agent de blocage du changement (couramment utilisé: lait, BSA, sérum ou gélatine)
    14Incapacité de l’anticorps primaire à reconnaître la protéine dans l’échantillon testé
    • Vérifier l’instruction
    • Utilisez un contrôle positif
    15Teneur faible ou nulle en protéine cible (antigène inefficace)
    • Utilisez un contrôle positif
    • Augmentez la quantité de charge à 20-30 µg de protéines par puits
    • Utiliser un inhibiteur de protéase ou une protéine cible d’extrait fractionnaire
    16Transfert insuffisant et lavage excessif
    • Vérifiez le transfert avec Ponceau S
    • Faire tremper la membrane PVDF dans le méthanol
    • Évitez les lavages excessifs
    17Sur-blocage
    • Utilisez du lait écrémé à 0,05% ou pas de tampon de diluant pour le lait
    • Changer l’agent de blocage
    • Réduisez le temps de blocage
    18Perte d’efficacité des anticorps primaires
    • Préparez des anticorps frais et conservez-les correctement lorsqu’ils ne sont pas utilisés
    • Évitez le gel et le dégel répétés
    19Inhibition des anticorps secondaires par l’azide de sodium
    • Évitez d’utiliser de l’azide de sodium avec des anticorps conjugués à HRP
    20Perte d’efficacité dans le conjugué enzymatique et le substrat
    • Mélanger le conjugué enzymatique et le substrat (pas de développement de couleur lorsque l’enzyme est inactive)
    • Utiliser un conjugué enzymatique activé et un substrat frais
    21Transfert humide incorrect pour la membrane
    • Faire tremper la membrane PVDF dans 100% de méthanol
    22Poids moléculaire insuffisant de la protéine cible (<10 kDa)
    • Utiliser une membrane de petit alésage
    • Réduisez le temps de transfert
    23Égalité ou proximité des valeurs entre le point isoélectrique de la protéine cible et le pH du tampon de transfert
    • Essayez d’autres tampons tels que le tampon CAPS (pH 10,5)
    • Essayez des tampons à faible pH tels que le tampon d’acide acétique
    24Concentration de méthanol trop élevée
    • Diminuez la concentration de méthanol ou utilisez de l’alcool isopropylique

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