Le guide suivant sert de liste de contrôle pour les causes et solutions possibles en ce qui concerne certains des problèmes les plus fréquemment rencontrés à partir des tests Western blot.

1. Contexte élevé
   S.No.Cause possibleSolution1Concentration d’anticorps trop élevée
   • Optimiser et diminuer la concentration d’anticorps
   2Formation d’anticorps secondaires agrégés
   • Filtrer l’anticorps secondaire à travers un filtre de 0,2 μm
   • Utilisez un nouvel anticorps secondaire
   3Température d’incubation des anticorps trop élevée
   • Incuber l’anticorps à 4 ° C
   4Liaison d’anticorps secondaire non spécifique ou réactivité croisée avec un agent bloquant
   • Exécuter un contrôle d’anticorps secondaire (sans le principal)
   • Diminue la concentration d’anticorps secondaire
   5Réactivité croisée de l’anticorps primaire ou secondaire avec l’agent bloquant
   • Ajouter Tween-20 à l’incubation et au tampon de lavage
   6Agent de blocage incompatible
   • Comparer différents tampons de blocage
   7Blocage incomplet
   • Optimiser le choix du tampon de blocage
   • Augmente la concentration en protéines dans l’agent bloquant
   • Optimiser le temps de blocage et / ou la température; Bloquer pendant 2 heures à température normale ou toute la nuit à 4 ° C
   • Ajouter 0,05% de détergent Tween 20 dans l’agent de blocage
   • Ajouter 0,05% de détergent Tween 20 dans la solution de diluants d’anticorps
   8Blocage insuffisant
   • Prolongez le temps de blocage ou utilisez un agent de blocage compatible (par exemple, lait écrémé, BSA, sérum, etc.)
   9Réactivité croisée de l’anticorps avec d’autres protéines
   • Utiliser un agent bloquant différent (ne pas utiliser de lait écrémé avec système de biotine
   • Réduire la concentration d’anticorps secondaire
   • Tester la réactivité croisée entre l’anticorps secondaire et la membrane
   dixLavage insuffisant
   • Augmentez le nombre de lavages et le volume de tampon
   • Ajouter 0,05% de détergent Tween 20 dans le tampon de lavage
   11Temps d’exposition trop long
   • Réduisez le temps d’exposition
   12Problème de membrane
   • Utilisez des pincettes propres; Opérer avec des gants
   • Utilisez de nouvelles membranes
   • Assurez-vous que le liquide est suffisant pour garder la membrane humide
   • Utiliser une table de décoloration en incubation
   • Évitez les membranes qui se chevauchent
   • Manipulez avec soin et évitez d’endommager la membrane
   13Lavage de membrane insuffisant
   • Augmentez le nombre de lavage
   14Membrane incompatible
   • Le fond de la membrane de nitrocellulose est inférieur à celui de la membrane PVDF
   15Membrane sèche
   • Assurez-vous que la membrane est recouverte d’une quantité suffisante de liquide et empêchez-la de sécher
   16Tampon contaminé
   • Utilisez un nouveau tampon ou un tampon de filtre avant utilisation
   17Équipements contaminés
   • Assurez-vous que tout l’équipement et les outils sont propres et qu’aucun gel ne reste sur la membrane
2. Signal faible / faible
   S.No.Cause possibleSolution1Mauvais transfert de protéines vers la membrane
   • Gel de coloration après le transfert pour déterminer si le transfert est efficace
   • Utilisez Ponceau S pour colorer la membrane afin de déterminer si le transfert est efficace
   • Assurer un contact suffisant entre le gel et la membrane pendant le transfert
   • Assurez-vous que le sandwich de transfert est correctement assemblé
   • Membrane humide selon les instructions
   • Évitez la surchauffe pendant l’électro-transfert
   • Utilisez un contrôle positif ou des marqueurs de poids moléculaire
   • Optimiser le temps de transfert et le courant
   • Utilisez le tampon de transfert de membrane de Boster (AR1149)
   • Évitez de détruire l’échantillon (déterminant antigénique) lors de la manipulation
   2Liaison insuffisante aux protéines et aux membranes
   • Ajout de 20% de méthanol dans le tampon de transfert
   • Utiliser une membrane de petit alésage
   3Anticorps insuffisant
   • Augmentez la concentration d’anticorps
   4Antigène insuffisant
   • Charger plus de protéines
   5Masquage d’antigène par tampon de blocage
   • Comparer différents tampons de blocage
   • Optimiser la concentration en protéines de l’agent bloquant
   • Réduisez le temps de blocage
   6Présence d’azide de sodium dans les tampons
   • Éliminer l’azide de sodium des tampons
   7Temps d’exposition trop court
   • Allonger le temps d’exposition du film
   8Temps d’incubation du substrat trop court
   • Allonge le temps d’incubation du substrat à cinq minutes
   9Digestion des protéines sur membrane
   • Optimiser la quantité d’agent bloquant
   dixDégradation des protéines pendant le stockage
   • Recréer l’échantillon de protéines
   11Anticorps primaires et secondaires incompatibles
   • Assurez-vous que l’anticorps primaire, l’anticorps secondaire, le substrat, le système enzymatique et les échantillons sont compatibles
   • Utilisez le contrôle de chargement pour tester l’efficacité du deuxième système de détection
   12Faible concentration d’anticorps primaire et / ou d’anticorps secondaire
   • Augmentez la concentration d’anticorps
   • Augmentez le temps d’incubation
   13Réactivité croisée entre l’agent bloquant et les anticorps (primaires ou secondaires)
   • Utilisez un détergent doux tel que Tween20
   • Agent de blocage du changement (couramment utilisé: lait, BSA, sérum ou gélatine)
   14Incapacité de l’anticorps primaire à reconnaître la protéine dans l’échantillon testé
   • Vérifier l’instruction
   • Utilisez un contrôle positif
   15Teneur faible ou nulle en protéine cible (antigène inefficace)
   • Utilisez un contrôle positif
   • Augmentez la quantité de charge à 20-30 µg de protéines par puits
   • Utiliser un inhibiteur de protéase ou une protéine cible d’extrait fractionnaire
   16Transfert insuffisant et lavage excessif
   • Vérifiez le transfert avec Ponceau S
   • Faire tremper la membrane PVDF dans le méthanol
   • Évitez les lavages excessifs
   17Sur-blocage
   • Utilisez du lait écrémé à 0,05% ou pas de tampon de diluant pour le lait
   • Changer l’agent de blocage
   • Réduisez le temps de blocage
   18Perte d’efficacité des anticorps primaires
   • Préparez des anticorps frais et conservez-les correctement lorsqu’ils ne sont pas utilisés
   • Évitez le gel et le dégel répétés
   19Inhibition des anticorps secondaires par l’azide de sodium
   • Évitez d’utiliser de l’azide de sodium avec des anticorps conjugués à HRP
   20Perte d’efficacité dans le conjugué enzymatique et le substrat
   • Mélanger le conjugué enzymatique et le substrat (pas de développement de couleur lorsque l’enzyme est inactive)
   • Utiliser un conjugué enzymatique activé et un substrat frais
   21Transfert humide incorrect pour la membrane
   • Faire tremper la membrane PVDF dans 100% de méthanol
   22Poids moléculaire insuffisant de la protéine cible (<10 kDa)
   • Utiliser une membrane de petit alésage
   • Réduisez le temps de transfert
   23Égalité ou proximité des valeurs entre le point isoélectrique de la protéine cible et le pH du tampon de transfert
   • Essayez d’autres tampons tels que le tampon CAPS (pH 10,5)
   • Essayez des tampons à faible pH tels que le tampon d’acide acétique
   24Concentration de méthanol trop élevée
   • Diminuez la concentration de méthanol ou utilisez de l’alcool isopropylique

DES PRODUITS